Как обустроить мансарду?



Как создать искусственный водоем?



Как наладить теплоизоляцию?



Как сделать стяжку пола?



Как выбрать теплый пол?



Зачем нужны фасадные системы?



Что может получиться из балкона?


Главная страница » Энциклопедия строителя

содержание:
[стр.Введение] [стр.1] [стр.2]

страница - 0

Использование моноклональных антител в диагностике и исследовании антигенных детерминант

Helicobacter pylori

Вечканов Е.М. (evechka@rambler.ru)

(1) Ростовский Государственный Университет, кафедра биохимии и

микробиологии

(2) Ростовский НИИ противочумной институт, лаборатория «Гибридом»

Долгое время господствовала версия о паразитическом образе жизни Н. pylori в желудке человека. Однако в настоящее время, господствующее положение постепенно приобретает версия о симбиотическом характере взаимоотношений человека и Н. pylori. Тем не менее, естественный симбионт Н. pylori, если подвергнуть его воздействию стрессорных факторов, начинает производство собственных факторов защиты, которые являются патогенными по отношению к человеку; таким образом, индуцируется повреждение эпителия слизистой оболочки желудка, ведущее к язвенной болезни, и стимулируется раковое перерождение железистого эпителия желудка. [4,5] Успешное лечение в таком случае напрямую зависит от полноты эрадикации хеликобактера из организма человека. Очевидна необходимость в точном, быстром и достаточно простом диагностикуме Н. pylori. Однако существующие на данный момент тест-системы либо недостаточно точны, либо некомфортны для пациента (инвазивные методы диагностики). В связи с этим представляется перспективным использование моноклональных антител (МКА), получаемых к поверхностным антигенам клеток Н. pylori, для создания точной и удобной тест-системы для обнаружения этого микроорганизма у пациента. Своевременное обнаружение Н. pylori позволяет указать на факторы риска развития язвенной болезни, если обследуемый здоров, или выработать правильную схему лечения, если патологии уже «дан ход».


Материалы и методы

В работе использовали микробные клетки Н. pylori кокковидной и вегетирующей форм, убитые нагреванием (100°С, 30 минут) и мертиолятом, а также культуральную жидкость гибридомы В10,- продуцента моноклональных антител полученной и любезно предоставленной лабораторией «гибридом» Ростовского НИПЧИ. Микробные клетки осторожно смывали с чашек Петри и суспендировали в буфере, состава: Tris-HCl 50 мМ, ЭДТА 1 мМ, рН = 6,5. Подготовленные таким образом образцы хранились в замороженном состоянии при минус 20 0С до использования. Перед проведением опыта образцы размораживали и смешивали в соотношении 1:1 с лизис-буфером состава: Tris-HCl 200 мМ, SDS 4%, бромфеноловый синий натриевая соль 0,01%, глицерин 40 %, в-меркаптоэтанол 400 мМ. Подготовленные таким образом пробы прогревали на водяной бане при 100 0С, в течение 5 мин. В пробах определяли количества белка по Лоури.

Характеристику антигенных детерминант осуществляли методом иммуноблоттинга. Принцип метода - разделение белковых детерминант с помощью диск-электрофореза в полиакриламидном геле по методу Laemmli [7], с последующим переносом разделённых белков на нитроцеллюлозную мембрану, по методу описанному Bjerrum. O. J., and C. Schafer-Nielsen [6] и иммуноферментным анализом дот-блот по Haid A., Suissa M.[8] Отдельно готовили пробы с вегетирующей и кокковидной формой Н. pylori. При приготовлении проб исходили из расчёта, чтобы на один карман геля приходилось порядка 100 мкг белка. Разделяющий гель готовился, исходя из конечной концентрации акриламида (акриламид + бис-акриламид) 12,5%, с 0,1% содержанием SDS.

Электрофорез проводился в течение 5 часов при напряжении 50 В. О ходе и скорости движения образцов судили по перемещению полосы красителя - бромфенолового синего. В качестве белков-метчиков использовались бычий сывороточный альбумин (Merck) (М=68 кДа) и химотрипсин (М=24 кДа) (Sigma).

По завершении электрофоретического разделения гель снимали со стёкол, складывали «сэндвич» для переноса и осуществляли перенос на нитроцеллюлозную мембрану согласно Bjerrum. O. J., and C. Schafer-Nielsen. [6] Подготавливали


нитроцеллюлозную мембрану (Membranfilter Scheicher & Schuell) (0,2 um) на 6 мм шире и длиннее геля, предварительно смоченную в буфере для переноса. Полиакриламидный гель после проведения электрофореза подрезали, помещали в буфер для переноса состава: Tris 47,9 мМ, Глицин 38,6 мМ, SDS 0,0385%, Этанол 20% на 10 мин при 00С. Накладывали гель на мембрану, прокладывали фильтровальным ватманом и помещали в камеру для переноса. Перенос осуществлялся в течение 30 мин, при напряжении 60 В. После блоттинга треки маркёров молекулярной массы окрашивали Ponceau S до проявления полос [1], а ту часть, где происходил перенос белковых антигенов, инкубировали с образцами антител гибридомы В10 и специфической поликлональной мышиной сывороткой по методу Haid A., Suissa M. [8] Использовался готовый набор вторичных антимышиных иммуноглобулинов, коанъюгированных с пероксидазой хрена - Goat Anti-Mouse Immunoglobulins-Peroxidase Conjugate Calbiochem® Immunochemicals. Полученный иммунодот проявляли с использованием диаминобензидина [2].

Результаты исследования

Исследовали состав белков H. pylori. Используемые пробы были следующего состава: проба № 1 - белковые метчики (бычий сывороточный альбумин (М=68 кДа) и химотрипсин (М=24 кДа), проба № 2 - лизат бактериальной массы Helicobacter pylori кокковидный формы (концентрация по белку 10 мкг/мкл), проба № 3 - лизат бактериальной массы Helicobacter pylori вегетирующей формы (концентрация по белку 10 мкг/мкл).

В результате электрофоретического фракционирования в полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия по методу Laemmli, был получен «белковый профиль», предствленный на Рис. 1. Окрашивание белковых полос осуществляли с помощью красителя Кумасси R-250. [1]




содержание:
[стр.Введение] [стр.1] [стр.2]

© ЗАО "ЛэндМэн"